RNA-Ligase-Ribozyme mit einem kleinen katalytischen Kern

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8584 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Katalytische RNAs oder Ribozyme katalysieren verschiedene chemische Reaktionen, die das ursprüngliche Leben in der hypothetischen RNA-Welt hätten aufrechterhalten können. Viele natürliche Ribozyme und im Labor entwickelte Ribozyme weisen eine effiziente Katalyse auf, die durch ausgeklügelte katalytische Kerne innerhalb komplexer Tertiärstrukturen vermittelt wird. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass derart komplexe RNA-Strukturen und -Sequenzen in der frühesten Phase der chemischen Evolution zufällig entstanden sind. Hier untersuchten wir einfache und kleine Ribozymmotive, die in der Lage sind, zwei RNA-Fragmente templatgesteuert zu ligieren (Ligase-Ribozyme). Eine einmalige Selektion kleiner Ligase-Ribozyme mit anschließender Tiefensequenzierung ergab ein Ligase-Ribozym-Motiv, das eine drei Nukleotide umfassende Schleife gegenüber der Ligationsverbindung umfasste. Die beobachtete Ligation war Magnesium(II)-abhängig und scheint eine 2′–5′-Phosphodiesterbindung zu bilden. Die Tatsache, dass ein so kleines RNA-Motiv als Katalysator fungieren kann, stützt ein Szenario, in dem RNA oder andere ursprüngliche Nukleinsäuren eine zentrale Rolle in der chemischen Evolution des Lebens spielten.

Die RNA-Welthypothese geht davon aus, dass RNA in einer frühen Phase der präbiotischen Evolution sowohl die Rolle eines Trägers genetischer Informationen als auch als Katalysator verschiedener Reaktionen spielte, die zur Aufrechterhaltung des ursprünglichen Lebens erforderlich sind1,2,3. Vorhandene RNA-Katalysatoren oder Ribozyme, wie Introns der Gruppe I4,5, selbstspaltende Ribozyme6,7,8,9 und der funktionelle RNA-Kern der Ribosomenmaschinerie10, werden als Beweis dafür angesehen, dass RNAs in der Lage sind, wichtige biologische Reaktionen zu katalysieren. Darüber hinaus haben In-vitro-Selektionsexperimente von Ribozymen aus zufälligen RNA-Sequenzen künstliche Ribozyme hervorgebracht, die verschiedene chemische Reaktionen mit beeindruckender Effizienz katalysieren können11,12. Die meisten dieser natürlichen und synthetischen Ribozyme enthalten jedoch einen komplexen katalytischen Kern innerhalb einer großen Struktur. Lange RNA-Sequenzen, die zur Kodierung solcher Ribozyme erforderlich sind, sind wahrscheinlich nicht zufällig in der frühen Phase der chemischen Evolution entstanden. Es ist wahrscheinlich, dass einfachere und kleinere, möglicherweise weniger effiziente Ribozyme vor der Entwicklung komplexer und effizienterer Ribozyme eine entscheidende Rolle im Urleben spielten.

In dieser Arbeit haben wir solche einfachen Ribozyme untersucht, die die templatgesteuerte Ligation von RNA-Fragmenten katalysieren können. Insbesondere haben wir Ribozyme ausgewählt, die die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einem freien 3′-Terminus eines RNA-Fragments und einem 5′-triphosphorylierten RNA-Fragment aus einer kleinen RNA-Bibliothek mit 7 oder 8 randomisierten Nukleotiden katalysieren können. Wir entdeckten einen kleinen katalytischen Kern, der aus einem Drei-Nukleotid-Motiv besteht, das sich gegenüber der Ligationsverbindung befindet. Die Ligation ergab eine 2′–5′-Phosphodiesterbindung. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die mögliche Rolle einfacher RNA-Motive mit katalytischer Aktivität bei der Entstehung des Lebens weitere Untersuchungen erfordert.

In unserer jüngsten Arbeit13 haben wir eine ursprünglich von der Joyce-Gruppe14 entdeckte RNA-Ligase F1* durch mehrere Runden des Ribozym-Sequenzdesigns und Hochdurchsatztests systematisch minimiert. F1 * enthielt einen 35-nt-Katalysatorkern, den wir durch diesen Prozess auf 18 nt (4d394, Abb. 1a) minimierten. Sowohl F1* als auch 4d394 katalysierten die Bildung einer 3′–5′-Phosphodiesterbindung zwischen dem Substratfragment und dem triphosphorylierten 5′-Terminus des Ribozyms auf templatgesteuerte Weise. Die Minimierung des katalytischen Kerns ging jedoch mit einer etwa 860-fachen Verringerung der katalytischen Effizienz einher. Wir beschlossen, nach noch kleineren katalytischen Motiven zu suchen, indem wir eine teilweise randomisierte Ribozym-Bibliothek, die in Abb. 1b dargestellt ist, nach Ligationsaktivität selektierten. Die Ribozymbibliothek Lib-N7/8 enthielt einen triphosphorylierten 5′-Terminus, der mit einer 5-bp-Stammschleife verbunden war, auf die ein randomisierter (N7 oder N8) katalytischer Kern folgte. Auf den mutmaßlichen katalytischen Kern folgen eine Substratbindungsdomäne und eine Primerbindungsstelle für die reverse Transkription (Abb. 1b).

Design und Analyse der Ribozym-Bibliothek. (a) Sekundärstrukturen von F1*- und 4d394-Ligase-Ribozymen mit verwandten Substraten. Katalytische Kerne sind rot dargestellt. (b) Ribozym-Bibliothek Lib-N7/8. Die rot dargestellten Nukleotide sind randomisiert. (c) Überblick über den Aufbau der Sequenzierungsbibliothek. Die ligierten und unligierten RNA-Stränge werden zunächst in cDNAs revers transkribiert (RT) und dann durch PCR amplifiziert. Ein weiterer PCR-Schritt fügt Adaptersequenzen für die Analyse durch MiSeq hinzu.

Lib-N7/8 enthält 81.920 (= 47 + 48) unterschiedliche Sequenzen. Die Bibliothek konnte 4 Stunden lang bei 42 °C in EPPS-Puffer, pH 8,5, ergänzt mit 25 mM MgCl2, mit dem Substratfragment T7Psub reagieren. T7Psub wurde entwickelt, um mit der Substratbindungsregion der Ribozymbibliothek zu hybridisieren und seinen 3′-Terminus in die Nähe des 5′-Endes des Ribozyms zu bringen. Die ligierten Produkte wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) isoliert.

Die gereinigten Ligationsprodukte wurden mithilfe einer Reversen Transkriptase in cDNAs umgewandelt. Die ligierten Produkte ergeben längere cDNAs, die am 3′-Ende die Sequenz enthalten, die T7Psub entspricht. Durch PCR-Amplifikation der cDNAs unter Verwendung geeigneter Primer werden die ligierten Sequenzen selektiv amplifiziert. Ein weiterer PCR-Schritt fügt weitere Adaptersequenzen hinzu, die für die Tiefensequenzierung mit Illumina MiSeq erforderlich sind (Abb. 1c). Aufgrund der geringen Anzahl an Varianten in der Bibliothek reichte eine Einzelrundenselektion aus, um katalytisch aktive Teilmengen nach Tiefensequenzierung anzureichern und zu identifizieren. Die zehn am häufigsten vorkommenden Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt, und die vollständigen Sequenzierungsergebnisse werden als Zusatzdaten 1 bereitgestellt. Die angereicherten Sequenzen zeigen einige klare Trends, zum Beispiel enden alle Sequenzen mit „GAU“, wobei 8 von 10 Sequenzen mit enden „GGAU“.

Die Vorhersage der Sekundärstruktur der am häufigsten vorkommenden Variante (N8-1) in Gegenwart von T7Psub unter Verwendung von NUPACK15 führt zu einem erweiterten einzelsträngigen Stamm-Schleifen-GGA, gefolgt von einer Watson-Crick-Wechselwirkung mit dem 3′-Ende von T7Psub (Abb . 2a). Die Sequenzähnlichkeit der anderen hochangereicherten Sequenzen legt nahe, dass sie sich ebenfalls in ähnliche Strukturen falten. Die Struktur legt nahe, dass das einzelsträngige GGA-Motiv zwischen den beiden Substratbindungsarmen als katalytischer Kern fungiert, um das 3'-Ende des Substrats T7Psub mit der 5'-triphosphorylierten GAG-Verlängerung stromaufwärts der Stammschleife zu verbinden.

Charakterisierung der N8-1-Katalyse. (a) Voraussichtliche Sekundärstruktur von N8-1 in Gegenwart von T7Psub durch NUPACK15. (b) Ligationskinetik von N8-1 mit T7Psub in Gegenwart von 10, 25 und 50 mM MgCl2. Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung (kobs) wurden geschätzt, indem die Anfangsgeschwindigkeiten der Reaktionen berechnet wurden, indem die Daten an lineare (10 und 25 mM) oder Polynomfunktionen dritter Ordnung (50 mM) angepasst wurden. Die Fehlerbalken geben den Bereich zweier unabhängig voneinander durchgeführter Messungen an. (c) Verdauung des N8-1-Ligationsprodukts durch Dz8-17-N8-1 zur Analyse der Ligationsregioselektivität. Spur 1: FAM-T7Psub als Größenmarker. Spur 2: N8-1-RNA (unmarkiert, nicht sichtbar). Spur 3: FAM-T7Psub-N8-1-Ligationsprodukt, hergestellt durch T4-RNA-Ligase, verdaut durch Dz8-17-N8-1. Spur 4: FAM-T7Psub-N8-1-Ligationsprodukt, katalysiert durch N8-1, verdaut durch Dz8-17-N8-1. Die mit einem Stern markierten unteren Bänder stammen vom verwendeten Ladefarbstoff.

Wir haben die Ribozymaktivität von N8-1 durch konventionelle Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) bestätigt. Fluoreszenzmarkiertes T7Psub (FAM-T7Psub) wurde mit einem Überschuss an unmarkiertem N8-1 umgesetzt, um eine Reaktion erster Ordnung anzunähern. Von den Reaktionsprodukten wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben genommen und mittels PAGE analysiert. Die Intensitäten der Banden, die dem nicht umgesetzten FAM-T7Psub und dem ligierten FAM-T7Psub entsprachen, wurden gemessen, um den Anteil des ligierten FAM-T7Psub zu berechnen (FL: ligierter Anteil). Mit 10 mM MgCl2 reagierten ~ 18 % von FAM-T7Psub nach 8 Stunden linear (kobs = 2,3 × 10−2 h−1) (Abb. 2b). Die Reaktionsgeschwindigkeit stieg ungefähr linear an, als die MgCl2-Konzentration auf 25 mM (kobs = 3,6 × 10−2 h−1) und 50 mM (kobs = 0,10 h−1) erhöht wurde (Abb. 2b). In Abwesenheit von MgCl2 wurde während des Versuchszeitraums keine Reaktion beobachtet (Daten nicht gezeigt).

Zuvor identifizierte RNA-Ligase-Ribozyme ergaben entweder 2′–5′- oder 3′–5′-Phosphodiesterbindungen. Wir untersuchten die Regioselektivität der N8-1-katalysierten Ligation, indem wir das Ligationsprodukt mit einem Desoxyribozym (DNAzym) 8–17 verdauten. DNAzym 8–17 (Dz8-17-N8.1, Tabelle 3) verdaut die 3′–5′-, aber nicht die 2′–5′-Phosphodiesterbindung16,17. Als Positivkontrolle synthetisierten wir mithilfe von T4-RNA-Ligase ein natives 3′–5′-Ligationsprodukt von FAM-T7Psub und N8-1. Die Behandlung des N8-1-katalysierten Ligationsprodukts mit Dz8-17-N8-1 ergab kein nachweisbares Spaltungsprodukt, während das T4-RNA-Ligase-katalysierte Ligationsprodukt eindeutig vom DNAzym angegriffen wurde (Abb. 2c und Abb. S1). Folglich ist es wahrscheinlich, dass N8-1 eine nichtkanonische 2′–5′-Phosphodiesterbindung ergibt. FAM-T7Psub-Analoga mit 2′-Desoxyadenosin oder 3′-Desoxyadenosin am 3′-Ende reagierten unter den gleichen Bedingungen nicht mit N8-1 (Daten nicht gezeigt). Daher scheint es, dass das 3′-OH eine gewisse Rolle bei der Beschleunigung der Reaktion spielt.

Frühere In-vitro-Selektionsexperimente haben Ligase-Ribozyme mit einer 2′-5′-Ligationsbindung ergeben18,19,20. Eines der frühesten Ribozym-Selektionsexperimente von Ekland und Mitarbeitern ergab 7 Familien von Ligase-Ribozymen, von denen 6 die 2′-5′-Ligation katalysierten18. Pitt und Ferré-D'Amaré verglichen die Strukturen von Ligase-Ribozymen, die 2′–5′- und 3′–5′-Bindungen ergeben, und beobachteten, dass die Konformationen der Nukleotide in der Nähe der Ligationsverbindung die Regioselektivität bestimmen21. Daher ist es wahrscheinlich, dass das N8-1-Motiv die 2′-OH-Gruppe des Substrats in eine günstige Ausrichtung bringt, um das α-Phosphoratom in der 5′-Triphosphatgruppe des Ribozyms anzugreifen.

Um quantitativere Einblicke in den katalytischen Kern von N8-1 zu gewinnen, wurde eine neue Bibliothek Lib-N5 erstellt, in der die fünf Nukleotide, die das GGA-Motiv enthalten, und die flankierenden Nukleotide randomisiert wurden (Abb. 3a). Die Auswahl und Sequenzierung in einer Runde wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Darüber hinaus haben wir die nicht ausgewählte Bibliothek sequenziert, um die Häufigkeit jeder Variante vor der Ligationsreaktion zu quantifizieren. Die Anreicherung jeder der 1024 Varianten in Lib-N5 wurde berechnet, indem die Häufigkeit der Variante nach der Selektion durch die Häufigkeit vor der Selektion dividiert wurde (Tabelle 2, Ergänzende Daten 1). Wie erwartet wurde N8-1 (UGGAU) bei der Selektion um das 233-fache am stärksten angereichert. Die Analyse der 18 Sequenzen, die eine zehnfache oder höhere Anreicherung zeigten, legt NNGA(U/C) als Konsensmotiv nahe (Abb. 3b). GA an den Positionen 3 und 4 bleibt konserviert und 15 der 18 Sequenzen enthalten U an Position 5, während die restlichen drei Sequenzen C enthalten. Dieses Ergebnis zeigt weiter, dass die Anforderung an katalytische Aktivität nicht sehr restriktiv ist.

Lib-N5-Auswahl. (a) Lib-N5-Design. (b) Konsenssequenz (Häufigkeitsdiagramm) der 18 Sequenzen, die eine Anreicherung von 10 oder mehr ergaben. Das Logo wurde von WebLogo22 generiert. (c) Ligationsverbindungen der Ribozyme N8-1, a4-20 und J4.

Die ersten drei Nukleotide GAG ​​von N8-1 scheinen nicht an der Watson-Crick-Basenpaarung beteiligt zu sein. Wir variierten das zweite und dritte Nukleotid von N8-1 (GNN), um die Sequenzanforderungen in der Nähe der Ligationsverbindung zu ermitteln (Abb. 4a). Das erste Guanosin wurde aufgrund der Notwendigkeit der T7-RNA-Polymerase, die zur Erzeugung der Ribozymvarianten verwendet wurde, nicht variiert. Die Varianten GAC und GCC wurden ebenfalls nicht untersucht, da In-vitro-Transkriptionsreaktionen unerwartete Produktgrößen ergaben (Daten nicht gezeigt). Von den 13 untersuchten Varianten lieferte GGG nach 4-stündiger Reaktion in 25 mM MgCl2 bei 42 °C 12 % Produkt, während N8-1 24 % ergab (Abb. 4b). Die anderen Einzelmutanten im zweiten Nukleotid (GCG und GUG) lieferten geringere (2,1 % und 3,6 %) aber nachweisbare Produkte. Die Varianten GAA, GAU und GGU ergaben ebenfalls nachweisbare Ligationsprodukte > 2 % (Abb. 4b). Daher scheint es, dass diese Nukleotide eine gewisse Rolle bei der Katalyse spielen.

Sequenzanforderung von N8-1 am 5′-Ende. (a) Mutierte Nukleotide (N) in N8-1. (b) Ligationsausbeuten von N8-1-Mutanten. Die ersten 3 Nukleotide der Mutanten sind aufgeführt. Die Ausbeuten wurden nach 4-stündiger Reaktion bei 42 °C in Gegenwart von 25 mM MgCl2 gemessen. Die Fehlerbalken stellen den Bereich zweier unabhängiger Messungen dar.

Natürliche Ribozyme wie das Gruppe-I-Intron haben hochentwickelte und komplexe Strukturen mit hoher katalytischer Effizienz23. In ähnlicher Weise konzentrierten sich Laborexperimente zur Evolution künstlicher Ribozyme hauptsächlich auf die Optimierung der katalytischen Aktivität und führten daher im Allgemeinen zu recht komplexen Sequenzen und Strukturen. Kleineren und weniger effizienten Ribozymsequenzen wurde weniger Aufmerksamkeit geschenkt, da solche Sequenzen in Evolutionsexperimenten im Labor schnell verloren gehen. Eine bemerkenswerte Ausnahme ist ein 5-Nukleotid-transaminoacylierendes Ribozym, das von der Yarus-Gruppe entdeckt wurde. Es wurde gezeigt, dass ein bemerkenswert kleiner katalytischer Kern aus drei Nukleotiden die Acylierung der 2′-Hydroxylgruppe eines Tetranukleotidsubstrats katalysiert24.

Gelegentlich beobachten Forscher Restaktivität eines kleinen Submotivs eines komplexen Nukleinsäureenzyms, das durch In-vitro-Selektion entdeckt wurde. Es wurde festgestellt, dass die Ligationsverbindung allein einer Klasse-II-Ligase von Ekland et al. (a4-20) die 2′-5′-Ligation katalysiert (Abb. 3c)18. Während dieses Motiv N8-1 verblüffend ähnlich sieht, war die beobachtete Ligationsrate deutlich niedriger (kobs = 5,4 × 10−5 h−1), wenn auch unter anderen Bedingungen (60 mM MgCl2, pH 7,4, 22 °C)18. Kürzlich entdeckten Mutschler et al. ein Tetranukleotid-Schleifenmotiv 5‘ GAAA 3‘, das die Ligation zwischen einem Fragment, das einen 2‘,3‘-zyklischen Phosphat-Terminus enthält, mit einem anderen Fragment mit einem 5‘-Hydroxyl-Terminus in einer templatgesteuerten Art und Weise katalysiert, was zu einer Ausbeute führt eine 2′–5′-Ligationsverknüpfung25. Interessanterweise ähneln das katalytische Motiv (J4) und die Ligationsverbindung denen von N8-1 (Abb. 3c). Abgesehen von der unterschiedlichen Aktivierungschemie zeigte das J4-Motiv beispielsweise im Vergleich zu N8-1 eine viel geringere Aktivität und ergab nach 5 Tagen unter optimalen Bedingungen eine Ausbeute von ~ 15 % Ligationsprodukt. Während die Selektion bei der Entdeckung dieser kleinen katalytischen Motive eine entscheidende Rolle gespielt hat, sind zusätzliche gezielte Anstrengungen für die Identifizierung langsamer, aber minimaler katalytischer Kerne unerlässlich.

Wir haben ein neues Motiv identifiziert, das nur aus drei Nukleotiden besteht und die templatgesteuerte RNA-Ligation deutlich beschleunigt. In Kombination mit wenigen anderen Beispielen ähnlich kleiner katalytischer Motive kann man davon ausgehen, dass es auch andere einfache RNA-Motive gibt, die zusätzliche Reaktionen katalysieren können. Während diese kleinen Ribozyme im Vergleich zu den größeren, aufwändiger konstruierten Gegenstücken eine bescheidene katalytische Effizienz aufweisen, könnten sie vor der Entstehung komplexer Maschinen, die lange RNAs genau replizieren können, eine wichtige Rolle in ursprünglichen lebenden Systemen gespielt haben.

Die Oligo-DNAs und RNAs wurden von Sigma-Genosys oder Eurofins mit Kartuschenreinigung erworben. Die Sequenzen sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Bibliotheken mit 7 degenerierten Basen (N7) und 8 degenerierten Basen (N8) wurden separat hergestellt und im Verhältnis 1:4 gemischt, sodass jede Variante in der endgültigen Bibliothek (Lib-N7/8) gleichermaßen vertreten war. Um die DNA-Vorlagen für die In-vitro-Transkription vorzubereiten, wurden jeweils 2 μM der Vorwärts- (LibT7P-f) und der Rückwärts- (LibT7P-N7-rt3-r oder Libt7P-N8-rt3-r) Oligos mit OneTaq 2X Master getempert und verlängert Mit Standardpuffer (New England Biolabs) in einem Volumen von 200 μL mischen. Die Reaktionslösungen wurden zunächst 5 Minuten lang bei 94 °C denaturiert, gefolgt von zwei Zyklen von 30 Sekunden lang bei 94 °C, 30 Sekunden lang bei 56 °C und 8 Sekunden lang bei 68 °C. Anschließend wurden die Lösungen 3 Minuten lang bei 68 °C gehalten, um eine vollständige Verlängerung sicherzustellen. Die DNA-Vorlagen wurden mit dem DNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research) gereinigt.

Die DNA-Vorlagen der Bibliothek wurden mit dem ScriptMax Thermo T7 RNA Polymerase Kit (Toyobo) gemäß den Anweisungen des Herstellers in RNA-Bibliotheken transkribiert. Konkret wurden die Reaktionen in einem Volumen von 10 μl unter Verwendung von 200 ng der DNA-Matrize durchgeführt. In-vitro-Transkriptionsreaktionen wurden 1 Stunde lang bei 50 °C durchgeführt. Anschließend wurden 10 μl DNase-Lösung (2 μl rekombinante DNase I (New England Biolabs), 2 μl 10 × DNase I-Puffer, 6 μl H2O) zugegeben und 10 Minuten lang bei 37 °C gehalten, um die DNA-Matrize zu verdauen. Die transkribierten RNA-Bibliotheken wurden mit dem RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research) gereinigt. Die RNA-Bibliotheken wurden bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.

Acht Mikroliter der Lib-N7/8-RNA (1,5 μM) wurden mit 4 μl des Substrats T7Psub (24 μM) gemischt. Die Mischung wurde 3 Minuten lang bei 70 °C inkubiert und dann auf Eis gestellt. Vier Mikroliter des 4 × Reaktionspuffers (200 mM EPPS pH 8,5, 100 mM MgCl2, 10 % RNase-Inhibitor, Maus (New England Biolabs)) wurden zur RNA-Lösung gegeben, um die Ligationsreaktion für 4 Stunden bei 42 °C zu starten Die Reaktion wurde durch Zugabe von 36 μl Stopplösung (1:2,6-Mischung aus 0,5 M EDTA und 2X RNA Loading Dye von New England Biolabs) gestoppt und bis zur Gelreinigung bei –80 °C gelagert.

Das Ligationsreaktionsgemisch wurde durch 8 % denaturierende PAGE aufgetrennt. Die ligierten Produkte wurden unter Verwendung eines Größenmarkers als Orientierungshilfe aus dem Gel herausgeschnitten. Das Gelfragment wurde bei –80 °C eingefroren und zerkleinert. Dem zerkleinerten Gel wurde Elutionspuffer (30 mM Tris-HCl pH 7,5, 30 mM NaCl) zugesetzt, um die RNA bei 4 °C unter 4-stündigem Schütteln bei 600 U/min zu extrahieren (ATTO WSC-2630, Power BLOCK Shaker). Die extrahierte RNA wurde mit einer Spin-Säule (Vivaclear MINI 0,8 μm, Sartorius) aus dem Gel isoliert und die RNA wurde mit Quick Precip Plus Solution (EdgeBio) mit Ethanol präzipitiert. Das RNA-Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen und in 10 μl nukleasefreiem Wasser suspendiert.

Die gereinigte RNA wurde mit Maxima H Minus Reverse Transkriptase (Thermo Fischer Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers revers transkribiert. Kurz gesagt wurde eine Mischung aus RNA (2,5 μL), 10 μM Primer rt3-r (1 μL), 10 mM dNTP-Gemisch (0,5 μL) und 3,25 μL H2O (insgesamt 7,25 μL) 5 Minuten lang bei 65 °C inkubiert durch Inkubation auf Eis. Dann wurde eine Mischung aus 2 μL 5 × Puffer, 0,25 μL RNase-Inhibitor und 0,5 μL Reverse Transkriptase hinzugefügt (insgesamt 10 μL). Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 65 °C durchgeführt, gefolgt von einer 5-minütigen Hitzeinaktivierung bei 85 °C. Die resultierende cDNA (0,5 μl) wurde unter Verwendung von OneTaq 2X Master Mix mit Standardpuffer (New England Biolabs) in einem Gesamtvolumen von 20 μl mit 0,2 μM Primern (R2-T7P-f und R1-bc2-T7P-rt3-r) PCR-amplifiziert ). Die Reaktionslösungen wurden zunächst 1 Minute lang bei 94 °C denaturiert, gefolgt von 12 Zyklen von 30 Sekunden lang bei 94 °C, 30 Sekunden lang bei 52 °C und 8 Sekunden lang bei 68 °C, gefolgt von einer 3-minütigen Inkubation bei 68 °C . Das PCR-Produkt wurde 25-fach mit Wasser verdünnt. Dieses verdünnte Produkt (15 μl) wurde mit Q5 High-Fidelity 2X Master Mix in einer 100 μl-Reaktion mit 0,5 μM Primern (TruSeq-i7-UDI0003 und TruSeq-i5-UDI0003) weiter amplifiziert. Die Reaktionslösungen wurden zunächst 30 Sekunden lang bei 98 °C denaturiert, gefolgt von 20 Zyklen mit 10 Sekunden lang 98 °C, 30 Sekunden lang 69 °C und 10 Sekunden lang 72 °C, gefolgt von einer 2-minütigen Inkubation bei 72 °C . Das PCR-Produkt wurde mit 3 % Agarosegel gereinigt und zur Sequenzierungsanalyse mit MiSeq (Illumina) geschickt.

Die Sequenzierungsbibliothek wurde mit MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina) analysiert. Es wurden einzelne Lesevorgänge für 130 Basen erfasst. Rohe Sequenzierungsdaten (Fastq-Datei) wurden von einem benutzerdefinierten Python-Skript analysiert. Die Reads, die die erwarteten konstanten Sequenzen enthielten, wurden verwendet, um die randomisierten 7 oder 8 Basen zu extrahieren. Nur die Sequenzen, die in allen randomisierten Positionen einen Qualitätsfaktor von 20 oder mehr ergaben, wurden beibehalten und für die Analyse gezählt. Insgesamt wurden 100.392 Lesevorgänge durchgeführt.

Die DNA-Matrize für die In-vitro-Transkription wurde wie oben beschrieben unter Verwendung der Oligo-DNAs T7p-N8-1-f und N8-1-rt3-r hergestellt. Die DNA-Matrize wurde verwendet, um N8-1-Ligase-RNA durch In-vitro-Transkription wie oben beschrieben zu erzeugen. Eine RNA-Mischung, die 12 μl 8,2 μM N8-1-Ligase-RNA und 6 μl 2,4 μM FAM-T7Psub enthielt, wurde 3 Minuten lang bei 70 °C inkubiert und dann auf Eis gestellt. Separat wurden 6 μl 4 × Reaktionspuffer (EPPS 200 mM pH 8,5, 40, 100 oder 200 mM MgCl2, 5 % RNase-Inhibitor) hergestellt. Die RNA-Mischung und die 4 × Reaktionspuffer wurden vor dem Mischen separat 3 Minuten lang bei 42 °C inkubiert, um die Ligationsreaktion zu starten (Endkonzentrationen: N8-1-Ligase 4,1 μM, FAM-T7Psub 0,6 μM, 10, 25 oder 50 mM). MgCl2, 50 mM EPPS, 1,25 % RNase-Inhibitor). Die Reaktion wurde bei 42 °C durchgeführt. Zu geeigneten Zeitpunkten (0, 2, 4, 6 und 8 Stunden) wurden 4 μl der Reaktionslösung gesammelt und mit 9 μl Stopplösung auf Eis gemischt. Die Proben wurden bis zur PAGE-Analyse bei -80 °C gelagert.

Die Proben wurden nach der Wärmebehandlung (95 °C für 3 Minuten) auf 8 % Polyacrylamidgele geladen. Die ligierten und unligierten Substrate wurden mit einem Typhoon FLA9500-Imager (GE Healthcare Life Sciences) abgebildet und quantifiziert. Die Bandenintensitäten wurden von ImageJ gemessen, um den Prozentsatz der Substrate zu berechnen, die zu jedem Zeitpunkt ligiert wurden.

In vitro transkribierte N8-1-RNA wurde mit Quick CIP (New England Biolabs) behandelt, um das 5'-Triphosphat zu entfernen, und dann durch T4-Polynukleotidkinase (Takara) gemäß den Anweisungen des jeweiligen Herstellers monophosphoryliert. Die phosphorylierte N8-1-RNA wurde durch T4-RNA-Ligase 1 (New England Biolabs) gemäß dem Protokoll des Herstellers an FAM-T7Psub ligiert, und das ligierte Produkt wurde durch PAGE wie oben beschrieben gereinigt. Diese RNA wurde als 3′–5′-Verknüpfungskontrollprodukt verwendet. In ähnlicher Weise wurden Ribozym-katalysierte Produkte aus der Reaktion zwischen N8-1 und FAM-T7Psub mittels PAGE gereinigt.

Die (Enzym oder Ribozym) ligierte RNA (125 fmol) wurde mit 100 pmol DNAzyme (Dz8-17b-N8.2) in einer 4 μL-Lösung gemischt, die 100 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5 und 0,25 mM EDTA enthielt. Die Mischung wurde 1 Minute lang auf 95 °C erhitzt, dann auf 37 °C (0,1 °C/s) abgekühlt, 10 Minuten lang bei 37 °C gehalten und schließlich auf 4 °C abgekühlt. Der durch DNAzyme katalysierte RNA-Verdau wurde durch Zugabe von 1,33 μl 5 × Puffer (125 mM MgCl2, 250 mM EPPS, pH 8,5), 0,665 μl RNase-Inhibitor und 0,665 μl 20 mM Spermidin (6,66 μl Endvolumen) eingeleitet und die Mischung inkubiert bei 37 °C für 1,5 h. TURBO DNase (Thermo Fisher Scientific) und sein Reaktionspuffer wurden bis zur Endkonzentration von 0,2 U/μL (13,3 μL Endvolumen) zugegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, um das DNAzym zu verdauen. Abschließend wurden 13,3 μl RNA Loading Dye (2X) hinzugefügt und wie oben beschrieben durch PAGE analysiert.

Lib-N5 wurde wie oben für Lib-N7/8 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Oligo-DNAs LibT7P-f und LibT7P-N5 für die DNA-Matrizenproduktion verwendet wurden. Lib-N5-RNA (0,75 μM) wurde an T7Psub (6 μM) in einem Gesamtvolumen von 16 μL im Reaktionspuffer (50 mM EPPS pH 8,5 als 5 × Puffer, 25 mM MgCl2, 2,5 % RNase-Inhibitor) bei 42 ° ligiert C für 4 Stunden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 36 μL der Stopplösung auf Eis gestoppt. Die ligierte RNA wurde gewonnen und wie oben beschrieben zur Sequenzierung verarbeitet. Es wurden zwei unabhängige Experimente (Ligationsreaktion) durchgeführt.

Die MiSeq-Analyse wurde im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt (Lib-N7/8). Nach der umgekehrten Transkription mit rt3-r als Primer wurde die erste PCR mit den Primern R2-T7P-f und R1-bc#-T7P-rt3-r (nach Ligation) oder R2-lig-f und R1-bc#- durchgeführt. T7P-rt3-r (vor der Ligation). „bc#“ bezeichnet die Barcode-Sequenz, die „vor“ oder „nach“ der Ligation und den beiden Wiederholungsexperimenten identifiziert. Die zweite PCR wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Die Lesevorgänge wurden nach Barcode sortiert und auf vollständige konstante Sequenzen überprüft. Sequenzen, bei denen alle randomisierten Positionen einen Qualitätsfaktor von 30 oder mehr ergaben, wurden beibehalten und gezählt. Die Gesamtzahl der Lesevorgänge für die vier Versuchsgruppen („vorher“ oder „nachher“, Wiederholung 1 oder 2) lag zwischen 195.928 und 696.654.

DNA-Matrizen für die In-vitro-Transkription wurden wie oben beschrieben unter Verwendung von Oligo-DNAs analog zu T7p-N8-1-f mit entsprechenden Mutationen am zweiten und dritten Nukleotid des transkribierten Ribozyms und N8-1-rt3-r hergestellt. Die DNA-Vorlagen wurden verwendet, um N8-1-Varianten durch In-vitro-Transkription wie oben beschrieben zu erzeugen. Die Ligationsreaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, wobei die endgültige MgCl2-Konzentration 25 mM bei 42 °C betrug. Die Proben wurden nach 4 Stunden abgeschreckt und wie oben beschrieben durch PAGE analysiert.

Alle nicht im Artikel oder in den ergänzenden Daten enthaltenen Daten werden auf Anfrage dem entsprechenden Autor zur Verfügung gestellt.

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Diese Arbeit wurde von der Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University (OIST) und dem KAKENHI-Stipendium 19H02855 (YY) der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) unterstützt.

Abteilung für Nukleinsäurechemie und -technik, Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University, Onna, Okinawa, 904-0495, Japan

Yoko Nomura und Yohei Yokobayashi

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YN und YY konzipierten die Arbeit und gestalteten die Experimente. YN führte alle Experimente durch. YN und YY haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Yohei Yokobayashi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nomura, Y., Yokobayashi, Y. RNA-Ligase-Ribozyme mit einem kleinen katalytischen Kern. Sci Rep 13, 8584 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35584-9

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Eingegangen: 22. Februar 2023

Angenommen: 20. Mai 2023

Veröffentlicht: 26. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35584-9

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